Proteinaza K: charakterystyka, aktywność enzymatyczna i zastosowania

Proteinaza K jest enzymem należącym do grupy proteaz serynowych, to znaczy ma w swoim aktywnym centrum katalitycznym aminokwas serynowy i ma funkcję rozbijania wiązań peptydowych przez hydrolizę. Enzym ten z kolei należy do rodziny białek subtylizyny (peptydazy S8).

Proteinaza K ma masę cząsteczkową (MW) 28 900 daltonów i została wyizolowana po raz pierwszy w 1974 roku z ekstraktów z albumu Engyodontium grzyba, wcześniej znanego jako album Tritirachium Limber.

Wykazuje wysoką zdolność proteolityczną, wykazując zdolność do degradacji keratyny obecnej we włosach. Słowo keratyna w języku angielskim jest napisane „keratyna”, dlatego zostało nazwane „proteinazą K”.

Ze względu na wysoką zdolność rozszczepiania natywnych białek enzym ten jest przydatny w różnych technikach biologii molekularnej. Stosowany jest głównie do izolacji i przygotowania kwasów nukleinowych o wysokiej masie cząsteczkowej (MW).

Proteinaza K działa poprzez uwalnianie jądrowego DNA, niszcząc białka i dezaktywuje RNazy i DNazy, to znaczy eliminuje nukleazy w preparatach DNA i RNA.

Z drugiej strony zaobserwowano, że proteinaza K może hydrolizować niektóre zdenaturowane białka natywne, co wzbudziło zainteresowanie naukowców do wykorzystania w badaniu białek prionowych (PrP C).

Jednak pomimo wysokiej siły proteolitycznej istnieją białka, które są oporne na działanie proteinazy K. Wśród nich są pewne nieprawidłowe białka zwane prionami (PrP Sc), związane z pasażowalnymi encefalopatiami gąbczastymi.

Charakterystyka proteinazy K

Proteinaza K ma trzeciorzędową strukturę utworzoną przez trzy warstwy, z arkuszem β siedmiu łańcuchów przeplatanym między dwiema warstwami helis. Ponieważ należy do rodziny peptydaz S8, charakteryzuje się triadą katalityczną w miejscu aktywnym, której kolejnością jest (Asp, His i Ser), co odróżnia je od innych rodzin peptydaz.

Ten enzym z grupy proteaz serynowych charakteryzuje się hydrolizą wiązań peptydowych w pobliżu grupy karboksylowej aminokwasów alifatycznych i aromatycznych.

Z drugiej strony, jest on zdolny do działania w obecności pewnych substancji żrących, takich jak dodecylosiarczan sodu (SDS), Tris-HCL i EDTA, które są używane do pomocy w denaturacji białek, powodując ich utratę naturalnej struktury.

Jest to wstępny krok w przygotowaniu białek do techniki elektroforezy. Zakres pH, w którym działa proteinaza K, jest dość szeroki (2, 0 do 12, 0), z optymalnym pH między 7, 5 a 12, 0, a jego punkt izoelektryczny wynosi 8, 9. Jak widać, jest aktywny w bardzo szerokim zakresie pH.

Inną cechą wyróżniającą się proteinazą K jest jej stabilność w obecności wysokich temperatur (50 - 60 ° C).

Aktywność enzymatyczna

Proteinaza K potrzebuje obecności jonów wapnia, chociaż nie wpływa to na jej aktywność, jeśli jest to niezbędne do utrzymania jej stabilności.

Aby proteinaza K mogła przeprowadzić pełne trawienie substratu, potrzebny jest przybliżony czas kontaktu między 5 minutami a 2 godzinami.

Jednak w tym sensie Daza i wsp. Porównali czystość DNA uzyskanego w różnych czasach ekspozycji na proteinazę K i doszli do wniosku, że przedłużona inkubacja (do 24 godzin) znacząco poprawia jakość DNA.

Teraz, w odniesieniu do stężenia używanego enzymu proteinazy K w różnych protokołach, można powiedzieć, że jest on bardzo zróżnicowany.

Można go stosować od bardzo niskich stężeń (5 μg / ml) do stężeń 500 μg / ml. Jednak najczęstsze stężenia robocze wahają się od 50-100 μg / ml, szczególnie w przypadku trawienia białek i inaktywacji nukleaz. Chociaż do leczenia tkanek wymagane jest stężenie 2 mg / ml.

Aplikacje

Jego zastosowania są bardzo szerokie i można je podsumować w następujący sposób:

- Jest stosowany do trawienia białek i ekstrakcji DNA za pomocą kilku metod, takich jak: wysalanie, PK-SDS, bromek cetylotrimetyloamoniowy (CTAB), zmodyfikowany octan potasu i ekstrakcja jodkiem sodu.

-Inaktywacja nukleaz (RNazy i DNazy).

-W technice hybrydyzacji in situ (HIS), aby pomóc w uwalnianiu kwasu nukleinowego, oprócz eliminacji niepożądanych białek.

-Modyfikacja białek.

- Na poziomie badań, w różnych badaniach.

Zalety proteinazy K

Przeprowadzono kilka badań porównawczych technik ekstrakcji DNA przy użyciu proteinazy K, a inne, które ich nie stosują, doszły do ​​wniosku, że stosowanie enzymu przynosi większe korzyści. Wśród zalet można wymienić:

- Uzyskano DNA o wysokiej masie cząsteczkowej, wysokiej jakości i czystości.

- Wyekstrahowane DNA jest stabilne przez okres do 3 miesięcy.

Wyekstrahowane DNA można stosować w następujących technikach: Southern blot, reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR), między innymi elektroforeza.

Białka odporne na proteinazę K

Kilka badań wykazało, że priony (nieprawidłowe białka toksyczne PrPSc) różnią się od białek PrPC (natywne), ponieważ są odporne na działanie proteinazy K, podczas gdy PrPC są wrażliwe na ich działanie.

Inni autorzy opisali, że w strukturze PrPSc są wrażliwe części i inne odporne na proteinazę K. Jednak obie części są równie toksyczne i zakaźne.

Z drugiej strony Bastian i współpracownicy w 1987 r. Wyizolowali 4 białka 28, 30, 66 i 76 kda z gatunku Spiroplasma mirum . Wszystkie były odporne na działanie proteinazy K, a także reagowały krzyżowo z niektórymi prionami.

Wiadomo, że gatunek ten może powodować zaćmę i istotne uszkodzenia neurologiczne, a ze względu na naukowe odkrycia Bastiana, wśród innych badań, podjęto próbę powiązania tego mikroorganizmu z pasażowalnymi gąbczastymi encefalopatiami.

Jednak etiologia tej zwyrodnieniowej patologii neurologicznej wciąż przypisywana jest prionom.

W tym sensie Butler i współpracownicy w 1991 r. Zidentyfikowali i scharakteryzowali klasę białka opornego na proteinazę 40 Kda z dwóch szczepów Mycoplasma hyorhinis. Ten patogen atakuje świnie, infekując ich tkanki, ale w tym przypadku nie było reakcji krzyżowej z testowanymi prionami.

Potrzeba więcej badań, aby wyjaśnić wiele niewiadomych na ten temat.