Barwienie Kinyoun: fundament i techniki

Barwienie Kinyoun to technika barwienia stosowana do barwienia bakterii i pasożytów odpornych na działanie kwasów. Urodziło się z modyfikacji kolorystyki Ziehla-Neelsena; Obie techniki są interpretowane w ten sam sposób, ale różnią się w dwóch elementach: w przygotowaniu głównego odczynnika iw tym, że technika Kinyoun nie wykorzystuje ciepła.

Z tego powodu jest również znany jako zimne barwienie Ziehl-Neelsen lub Kinyoun na zimno. Jest wskazany do zabarwienia Mycobacterium tuberculosis, Micobacterium leprae, nietypowych mykobakterii, Nocardias sp, Cryptosporidium parvum, Cryptosporidium meleagridis, Cryptosporidium felis, Cryptosporidium muris i Cyclosporas cayetanensis .

Warto zauważyć, że Nocardias zabarwiają się słabo tą techniką, ponieważ są alkoholem częściowo kwasoodpornym, więc dla tego gatunku istnieje modyfikacja metodologii.

Z kolei zimną technikę Kinyoun połączono z techniką trichromu zmodyfikowaną przez Didiera w celu wykrywania kokcydii ( Criptosporidium parvum i Isospora belli ) i zarodników mikrosporidii ( Enterocytozoon bieneusi i Encephalitozoon intestinalis ).

Fundacja

Głównym odczynnikiem barwiącym jest fuksyna karbolowa lub fuksyna fenikainowa, która ma właściwości wiązania się z kwasami karbolowymi w woskowej ścianie komórkowej, bogatej w lipidy (kwasy mikolowe) mykobakterii i niektórych pasożytów.

Tym związkom nie przeciwdziała odbarwianie kwasem; dlatego mikroorganizmy są zdefiniowane jako alkohol kwasoodporny.

W przeciwieństwie do techniki Ziehla-Neelsena - która utrwala barwnik przez ciepło - w technice Kinyouna ten krok nie jest konieczny, ponieważ fenolowy roztwór fuksyny przygotowany do tej techniki zawiera wysokie stężenie fenolu.

Fenol rozpuszcza materiał lipidowy ściany komórkowej, co pozwala na wprowadzenie barwnika fuksyny karbolu. Po wniknięciu barwnika pozostaje on nieruchomy pomimo mycia kwasem alkoholowym.

W ten sposób odporne na kwasy mikroorganizmy nabierają charakterystycznego czerwonego koloru, podczas gdy wszystko, co nie jest alkoholem kwasoodpornym, staje się odbarwione i barwione na niebiesko.

Technika

Materiały

- Zmodyfikowana fuksyna fenolowa.

- Kwas alkoholowy.

- Błękit metylenowy.

Przygotowanie fuksyny finy Kinyoun

- Podstawowa fuksja: 4 gr.

- Fenol: 8 ml.

- Alkohol (95%): 20 ml.

- Woda destylowana: 100 ml.

Podstawowa fuksyna w alkoholu musi być rozpuszczana powoli, stale mieszając. Następnie skrystalizowany fenol topi się w łaźni wodnej w 56 ° C. Po rozpuszczeniu 8 ml dodaje się do roztworu fuksyny przygotowanego powyżej.

Przygotowanie kwasu alkoholowego

- Stężony kwas solny: 3 ml.

- Etanol (95%): 97 ml.

Musi być mierzona, łączona i mieszana.

Wytwarzanie barwnika kontrastowego z błękitem metylenowym

- Błękit metylenowy: 0, 3 g.

- Woda destylowana: 100 ml.

Waży i rozpuszcza się.

Technika bejcy kinyoun

1- Przygotować rozmaz bezpośrednio z próbki, którą może być między innymi plwocina, płyn płucny, osad moczu, płyn mózgowo-rdzeniowy lub kał; lub z zawiesiny mikroorganizmów uzyskanych z czystych kolonii hodowanych w pierwotnych pożywkach hodowlanych.

2- Napraw rozmaz ciepłem.

3- Umieścić rozmaz na mostku barwiącym i przykryć przygotowanym odczynnikiem fenolowo-fuksynowym Kinyoun. Niech odpocznie przez 3 lub 5 minut.

4- Umyć wodą destylowaną.

5- Wybiel kwaśnym alkoholem przez 3 minuty i ponownie umyj wodą destylowaną.

6 - Ponownie wybiel kwaśnym alkoholem przez 1 lub 2 minuty, aż nie będzie już przeciągany barwnik.

7- Umyć wodą destylowaną i odcedzić, umieszczając szkiełko w pozycji pionowej.

8- Przykryj preparat błękitem metylenowym i pozostaw na 4 minuty.

9- Umyć wodą destylowaną i pozostawić do wyschnięcia na powietrzu.

10- Sprawdź w 40X, a następnie w 100X.

Jeśli chcesz poprawić i przyspieszyć barwienie mikroorganizmów kwasoodpornych, dodaj 1 kroplę środka zwilżającego (takiego jak tergitol nr 7) do 30 lub 40 ml fuksyny Kinyoun fenic acid.

Niektóre laboratoria zmieniają barwnik kontrastowy z błękitem metylenowym na kwas jasnozielony lub pikrynowy; pierwszy daje zielony kolor tła, a drugi generuje żółty kolor.

Specjalna technika Kinyoun dla Nocardias

Aby poprawić barwienie bakterii Nocardia, zastosowano modyfikację barwienia Kinyoun. Technika jest następująca:

1- Pokryj rozmaz fuksyną fenolową Kinyoun przez 3 minuty.

2- Umyć wodą destylowaną.

3- Rozcieńcz krótko 3% kwaśnym alkoholem, aż nie będzie więcej barwnika.

4- Ponownie umyć wodą destylowaną.

5- Przykryć preparat błękitem metylenowym i pozostawić na 30 sekund.

6- Umyć wodą destylowaną i pozostawić do wyschnięcia na powietrzu.

Połączona technika fenolowej i trichromowej fuksyny zmodyfikowanej przez Didiera

Ta technika jest zalecana do analizy próbek kału w poszukiwaniu kokcydii i zarodników Microsporidium sp jednocześnie. Procedura, której należy przestrzegać, jest następująca:

1- Zakryj rozmaz fuksyną fenolową Kinyoun przez 10 minut.

2- Usunąć barwnik i umyć wodą destylowaną.

3- Wybielanie przez 30 sekund kwasem solnym z alkoholem.

4- Ponownie umyć wodą destylowaną.

5- Pokryj rozmaz roztworem trichromu przez 30 minut w 37 ° C.

6- Umyć wodą destylowaną.

7- Odbarwiać przez 10 sekund alkoholowym kwasem octowym.

8- Wymyj wymaz przez 30 sekund przy użyciu 95% etanolu.

Kontrola jakości

Jako kontrolę pozytywną przygotowuje się rozmazy ze szczepami Mycobacterium tuberculosis i barwione przygotowanymi odczynnikami, aby sprawdzić, czy bakterie przybierają właściwy kolor (czerwono-fuksja).

Kontrole negatywne można również stosować przez przygotowanie rozmazów z dowolnym szczepem, który nie jest odporny na działanie kwasów, co potwierdza, że ​​cała próbka przybiera kolor kontrastu.

Technika Kinyoun w porównaniu do techniki Ziehla -Neelsen

Technika Kinyoun jest prostsza, ponieważ eliminuje etap ogrzewania, ale jego główną zaletą jest to, że zapobiega emisji oparów, wysoce toksycznych i powodujących raka w dłuższej perspektywie. Dlatego barwienie Kinyoun jest bezpieczniejsze dla personelu odpowiedzialnego za barwienie.

Ważne jest, aby wziąć pod uwagę, że należy uważać, aby odczynniki nie miały bezpośredniego kontaktu ze skórą, ponieważ są one żrące, a wybielacz jest łatwopalny.

Jeśli chodzi o wady, negatywny rozmaz niekoniecznie oznacza, że ​​mikroorganizm nie jest obecny. Ponadto obecność detrytusu komórkowego może powodować fałszywie dodatnie wyniki, co powoduje zamieszanie w diagnozie.

Odniesienie

1. Applied Clinical Chemistry (2016). Zestaw BK Kinyoun. Dostępny na: cromakit.es
2. Orozco-Rico Miguel. Barwnik Kinyoun i dwie Kokcydia w HIV. Medical Journal MD. 2011; 3 (2): 137
3. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A (2009). Diagnostyka mikrobiologiczna Bailey & Scott. 12 ed. Argentyna Od redakcji Panamericana SA
4. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Diagnostyka mikrobiologiczna. (5 wyd.). Argentyna, Redakcja Panamericana SA
5. Twórcy Wikipedii. «Plama Kinyoun.» Wikipedia, The Free Encyclopedia . Wikipedia, The Free Encyclopedia, 8 lutego 2018 r. Web. 5 stycznia 2019 r.
6. Combol A, Fernández N, Figueredo E, Acuña A, Zanetta E. Wdrożenie techniki barwienia dla jednoczesnej diagnozy Coccidia i Microsporidia. Instytut Higieny Uniwersytetu Republiki. Montevideo. Urugwaj Dostępne pod adresem: higiene.edu.uy